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用二氧化碳培養(yǎng)箱做細(xì)胞培養(yǎng)及凍存

更新時(shí)間:2020-05-27  |  點(diǎn)擊率:2115

  首先做實(shí)驗(yàn)所需儀器耗材如下:
    二氧化碳培養(yǎng)箱、液氮罐、超低溫低溫冰箱、電熱恒溫水浴鍋、離心機(jī)等。

   培養(yǎng)皿、滴瓶、吸管、離心管、燒杯、量筒、三角瓶、培養(yǎng)瓶等

下面小編給大家說下簡易的實(shí)驗(yàn)步驟

    將凍存細(xì)胞從液氮中取出后,在37℃電熱恒溫水浴鍋內(nèi)不斷搖動(dòng)促進(jìn)其融化。移入15ml離心管中,加入10ml預(yù)熱的DMEM*培養(yǎng)基,輕輕吹勻,離心2min,棄上清液。加入10ml DMEM培養(yǎng)基清洗,棄上清液。加入10ml DMEM*培養(yǎng)基,輕輕吹打,接種于10cm盤中,在含5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

     細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時(shí).去培養(yǎng)基,10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶,放入二氧化碳培養(yǎng)箱3min。加人1ml DMEM*培養(yǎng)基終止胰酶消化,轉(zhuǎn)移至15ml離心管。加入10ml PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤,轉(zhuǎn)移至15ml離心管離心2min,棄上清液。再加入10ml PBS(經(jīng)滅菌,保存于40℃)吸取10微升進(jìn)行計(jì)數(shù),按照1×105/盤接種,在含5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

       加入1ml凍存液(90%血清,10%DMSO),放入凍存盒內(nèi),立即放入一80℃超低溫冰箱內(nèi),過夜,第二天放入液氮中,可以保存至少兩年,如不放入可以保存90天。

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